苏州东岭生物技术有限公司 | Real-titer慢病毒滴度测定（Q-PCR）试剂盒

Real-titer慢病毒滴度测定（Q-PCR）试剂盒

Real-titer 慢病毒滴度测定（Q-PCR）试剂盒

Real-titer慢病毒滴度测定（Q-PCR）试剂盒

本试剂盒能够快速、简便、高效地对基于HIV-1构建的慢病毒进行有效滴度测定。通过对感染慢病毒的细胞基因组DNA中整合的慢病毒插入片段拷贝数进行Q-PCR测定，计算出初始病毒的有效滴度。

规格：详见产品内容

产品号：

# GE-20006-100

产品内容：

试剂名称	内容	数量
Solution 1	标准品DNA模板（5x10^9 copies/μl）	100μl
Solution2	Lenti-primer (10μM)	40μl
Solution 3	Lenti-probe –FAM/TAMRA(2.5μM)	80μl
Solution 4	Taq (probe qPCR) (2X)	1ml
Solution 5	ROXI(50X)	40μl
Solution 6	ROX II(50X)	80μl

其他所需材料：

细胞基因组DNA抽提试剂（离心柱法）

超纯水

Q-PCR用96孔板或8连管

定量PCR仪

1.5ml无酶离心管用于样品制备

无酶枪尖

储存条件：

所有试剂储存于-20℃，应避免反复冻融，请根据实验情况分装使用。

简介：

优势：

1.因本品所用模板为感染病毒后靶细胞基因组，与以病毒RNA为模板进行的滴度测定相比，所得滴度为病毒的真实感染滴度，即活性滴度，对后续实验有更准确的指导意义；

2.本品检测试剂基于Taqman探针法开发，结果更准确；

3.检测位点位于HIV-1病毒基因组保守区，适用于所有基于HIV-1病毒构建的慢病毒滴度测定。

操作流程：

操作步骤：

Real-titer慢病毒滴度测定（Q-PCR）试剂盒说明书（点击下载）

本说明概述了从感染慢病毒的293T细胞基因组中测定所用病毒滴度的方法，Q-PCR直接所得数据为所取细胞中慢病毒的拷贝数，用户可根据计算公式，对最终滴度进行相应计算。

Q-PCR相对灵敏，请尽量确保实验环境及所用试剂耗材无其他DNA和DNase污染。

1.取感染72h后的293T细胞，胰酶消化制备单细胞悬液，细胞计数，得细胞数为N;

2.利用细胞基因组抽提试剂盒提取293T细胞基因组DNA，测定基因组DNA总量为G (μg)，稀释至50ng/μl备用；

注：此步骤推荐使用分离柱式基因组抽提试剂盒

3.根据下表稀释标准品及基因组DNA样品：

	标准品管				样品管
#	稀释倍数	Water	标准品	拷贝数/μl	稀释倍数	Water	样品(50ng/μl)
1	10^1	45μl	5μl	5.45x10^8	10	45μl	5μl
2	10^2	45μl	5μl of 1#	5.45x10^7	50	40μl	10μl of #1
3	10^3	45μl	5μl of 2#	5.45x10^6	100	45	5μl of #1
4	10^4	45μl	5μl of 3#	5.45x10^5
5	10^5	45μl	5μl of 4#	5.45x10^4
6	10^6	45μl	5μl of 5#	5.45x10^3

梯度稀释取样前，需充分混匀；

4.根据下表配制反应液，每组配制3个复孔：

试剂	用量	终浓度
标准品或样本	2μl	*1
Lenti-primer (10μM)	0.4μl	0.2μM
Lenti-probe (2.5μM)	0.8μl	0.1μM
Taq (probe qPCR) (2X)	10μl	1X
ROX	*2
Water	补至20μl

*1：样本除步骤3中稀释的3种浓度外，另需一组未稀释样本，即总量为100ng/孔；另需设置阴性对照孔，即不添加任何DNA模板；

*2：根据所使用仪器添加：

	适用仪器
ROX I (终浓度1X)	7300 Real-Time PCR System/ StepOnePlus Real-Time PCR System
ROX II (终浓度0.5X)	7500 Real-Time PCR System/7500 Fast Real-Time PCR System
无需ROX	Thermal Cycler Dice Real Time System series/ LightCycler 480 System/ CFX96 Real-Time PCR Detection System

5.上机，按照以下程序进行Q-PCR反应：

Denature (1 Cycle)

95℃ 30s

Quantification (40 cycles)

95℃ 5s

60℃ 30s

注：可根据具体使用仪器自行调整程序。

6.计算标准曲线：计算每组标准品的平均Ct值，以平均Ct值为X，Log_e^{(copy number)}为Y，生成标准曲线Y=A*Ct+B。标准曲线R²需大于0.99；（具体过程可见举例）

7.计算样本平均Ct值，带入标准曲线计算出copy number=n。

注：以Ct值在标准曲线范围内的数据为准，若样本Ct值超过或低于标准曲线Ct值，需对样本稀释倍数进行相应调整。

8.计算病毒滴度：举例

Titer(TU/ml)=[n*d*(G/0.1)/N]*N^ori/V

其中：n=步骤7中计算所得拷贝数；d=所用Ct值对应的稀释倍数(1, 10, 50, 100)；G=基因组提取所得DNA总量(μg)；N=基因组提取所用细胞数；N^ori=病毒感染时细胞数；V=病毒感染时病毒用量(ml)。

计算各个Ct值位于标准曲线范围内的不同稀释倍数组病毒滴度，取平均值为最终结果。（具体过程可见举例）

常见问题：

常见问题	建议
转染孵育后沉淀不可见或太细	加入了太多的DNA。检查DNA的OD260并适当调整使用的体积或浓度。用不同数量的DNA转染以确定最佳浓度。
转染孵育后沉淀物密度太大，有聚集的团块	加入的DNA太少。检查DNA的OD260并适当调整使用的体积或浓度。用不同数量的DNA转染以确定最佳浓度。
无法从培养皿中洗去沉淀物	确保PBS不含Ca²⁺或Mg²⁺，洗液只含有配方中所列成分的阳离子。
转染效率高，但病毒滴度低	优化病毒表达质粒和包装质粒的比例和用量，理论上表达质粒越大，包装所需用量越多。

附录：

不同规格培养皿底包装体系参考:

	6孔板	10cm培养皿	15cm 培养皿
底面积	cm²	Cm²	Cm²
底面积比	1	5.7	15.8
转染前换液体积	1.226 ml	7 ml	17.5 ml
DNA-CaPO₄ mixture体积	0.174 ml	1 ml	1.5 ml
培养体积	2 ml	10 ml	25 ml
洗涤体积	2 ml	10 ml	25 ml