试剂名称 | 内容 | 规格 | 储存 条件 | |
-20T | -50T | |||
Solution 1 | 2.5M CaCl2 | 2ml | 5ml | -20oC |
Solution2 | 2× BBS | 10ml | 25ml | |
Solution 3 | Modified Fetal bovine serum | 10ml | 25ml | |
Solution 4 | Packaging Enhancer (1000×) | 100μl | 250μl | |
Solution 5 | Infection Enhancer (1000×) | 100μl | 250μl | |
Controlplasmid | CMV-EGFP | 40μg | 100μg | |
UltrapureH2O | H2O | 10ml | 25ml | 4oC |
操作流程:
1.提前一天消化293T细胞,重悬于37℃预热的DMEM完全培养基中(10%FBS,无抗生素,以下简称为D10),计数;
2.每个培养皿接种4.5×10^6细胞,10mlD10,轻轻晃动,将细胞完全混匀;
3.在含5%CO2培养箱中37℃培养过夜(转染前细胞密度应达到60%-70%,可根据细胞生长速度对细胞接种量作调整);
4.转染前3h配制含有2.5%Solution3的DMEM培养基(以下简称为D2.5,不含双抗),37℃预热备用;
5.转染前2h吸去培养皿中培养基,每皿更换7ml上一步预热的D2.5,放入培养箱中备用,注意避免细胞脱落;
6.准备涡旋仪,70%酒精擦拭消毒后置于无菌操作台备用;
7.根据下表准备DNA混合液(该体系以慢病毒包装载体pMD2G和psPAX为例,为1个100mm培养皿用量):
试剂 | 用量 |
pMD2G | 6μg |
PSPAX | 15μg |
慢病毒表达载体 | 20μg |
H2O | Add H2O to 450μl |
8.边涡旋边逐滴加入50μl Solution 1,以充分混匀;
9.在15ml离心管中准备等体积500μl Solution 2,在涡旋仪上快速涡旋,同时逐滴加入配制好的DNA混合液(该过程必须逐滴加入);滴加结束后再涡旋5-10s;
10.将混合液室温孵育20min;
11.同时,在待转染细胞培养皿中加入8μl Solution4,混匀后放于培养箱备用;
12.孵育结束后用移液枪或移液管轻轻混匀混合液,此时可见混合液略有浑浊;
13.将混合液逐滴均匀滴加至培养皿中,前后左右轻轻晃动培养皿,充分混匀;
14.将培养皿放于含3%CO2培养箱中培养;
15.12-16h之后(不超过16h),37℃预热DMEM无血清培养基(可用PBS代替)和D2.5;
16.吸去培养皿中培养基,用预热的DMEM无血清培养基轻轻洗2次,10ml/次,之后加入10ml上步预热的D2.5,混匀后置于含5%CO2培养箱中37℃培养;
17.转染36-48h后收集培养上清,2200rpm,4℃离心10min去除细胞碎片,置于4℃冰箱短期保存(不超过2天),或分装后于-80℃长期保存。
18.收集的病毒上清可直接用于滴度测定,或浓缩后分装保存;
本公司同时提供病毒浓缩试剂(货号:GE-19002-50),可方便快捷高效地浓缩病毒,不需要超速离心机。
1.提前一天接种293T细胞于96孔板,每孔1×10^4细胞,100μl;培养过夜;
2.准备含有1× Solution 5的DMEM完全培养基(10%FBS),37℃预热;
3.消化10孔细胞,计数,算出每孔细胞数N;
4.根据下图逐级稀释病毒,并在对应细胞中加入10μl稀释好的病毒;
5.每孔加入100μl准备好的DMEM完全培养基,2000rpm,30℃离心1h;
6.离心结束后将细胞放回培养箱中培养;
7.72h后,收集细胞,流式测定阳性细胞百分比TM%,选择15-25%之间的TM%用于滴度计算;
8.根据以下公式计算病毒滴度:
Virus titer, TU/ml
DF:病毒稀释倍数;
V:每孔加入病毒体积,0.01ml;
常见问题 | 建议 |
转染孵育后沉淀不可见或太细 | 加入了太多的DNA。检查DNA的OD260并适当调整使用的体积或浓度。用不同数量的DNA转染以确定最佳浓度。 |
转染孵育后沉淀物密度太大,有聚集的团块 | 加入的DNA太少。检查DNA的OD260并适当调整使用的体积或浓度。用不同数量的DNA转染以确定最佳浓度。 |
无法从培养皿中洗去沉淀物 | 确保PBS不含Ca2+或Mg2+,洗液只含有配方中所列成分的阳离子。 |
转染效率高,但病毒滴度低 | 优化病毒表达质粒和包装质粒的比例和用量,理论上表达质粒越大,包装所需用量越多。 |
6孔板 | 10cm培养皿 | 15cm 培养皿 | |
底面积 | cm2 | Cm2 | Cm2 |
底面积比 | 1 | 5.7 | 15.8 |
转染前换液体积 | 1.226 ml | 7 ml | 17.5 ml |
DNA-CaPO4 mixture体积 | 0.174 ml | 1 ml | 1.5 ml |
培养体积 | 2 ml | 10 ml | 25 ml |
洗涤体积 | 2 ml | 10 ml | 25 ml |