苏州东岭生物技术有限公司 | Acme-packaging病毒包装试剂盒

Acme-packaging病毒包装试剂盒

Acme-packaging病毒包装试剂盒

Acme-packaging病毒包装试剂盒

本试剂盒包含能够快速、简便、高效地对293T细胞进行质粒转染的必要试剂，可同时用于慢病毒和逆转录病毒的包装，可在100mm培养皿中进行20-50次转染。Solution 1和Solution2用于形成CaPO₄沉淀；Solution3为本公司生产并经严格筛选的胎牛血清，用于病毒包装过程中添加到细胞培养基中；Solution 4为病毒包装增强试剂，可有效提过病毒包装效率；Solution 5为病毒感染增强试剂，用于靶细胞感染；Controlplasmid为EGFP慢病毒质粒，用于包装阳性对照病毒。

规格：详见产品内容

产品号：

# GE-19001-20/50

产品内容：

试剂名称	内容	规格		储存条件
试剂名称	内容	-20T	-50T	储存条件
Solution 1	2.5M CaCl₂	2ml	5ml	-20^oC
Solution2	2× BBS	10ml	25ml
Solution 3	Modified Fetal bovine serum	10ml	25ml
Solution 4	Packaging Enhancer (1000×)	100μl	250μl
Solution 5	Infection Enhancer (1000×)	100μl	250μl
Controlplasmid	CMV-EGFP	40μg	100μg
UltrapureH₂O	H₂O	10ml	25ml	4^oC

注：Solution 1、Solution 2应避免反复冻融，请根据实验情况分装使用。

其他所需材料：

超纯水

293T (Acme-293T，东岭生物)

DMEM高糖培养基

Fetal bovine serum (FBSV500，东岭生物)

磷酸盐缓冲液 (PBS: 137 mM NaCl, 2.6 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, Adjust the pH to 7.4 with HCl)

简介：

在包装重组病毒的过程中，质粒转染是影响病毒包装效果的重要一步。本试剂盒是基于CaPO₄法开发的病毒包装试剂盒，在293T细胞中有非常好的转染效果。

CaPO₄法最初是作为检测病毒DNA传染性的一种技术而发展起来的，由CaPO₄形成的沉淀通过增强DNA对细胞膜的吸附作用，促进哺乳动物细胞对DNA的摄取，从而达到转染的目的。CaPO₄沉淀还限制了哺乳动物细胞内DNA酶对DNA的消化。

操作流程：

操作步骤：

Acme-packaging病毒包装试剂盒说明书（点击下载）

请在实验开始前认真阅读完整实验步骤

本说明概述了使用100mm细胞培养皿进行瞬时转染包装慢病毒所需的步骤，逆转录病毒包装体系及条件略有不同。如果使用其他规格培养皿，请根据培养皿底面积按比例调整相关试剂用量(参考附录)。质粒用量及比例可根据推荐用量做优化。

病毒包装对细胞状态有较高要求，推荐使用传代次数较低、扩增倍数稳定、形态正常的细胞用于包装。

病毒包装：

1.提前一天消化293T细胞，重悬于37℃预热的DMEM完全培养基中（10%FBS，无抗生素，以下简称为D10），计数；

2.每个培养皿接种4.5×10^6细胞，10mlD10，轻轻晃动，将细胞完全混匀；

3.在含5%CO₂培养箱中37℃培养过夜（转染前细胞密度应达到60%-70%，可根据细胞生长速度对细胞接种量作调整）；

4.转染前3h配制含有2.5%Solution3的DMEM培养基（以下简称为D2.5，不含双抗），37℃预热备用；

5.转染前2h吸去培养皿中培养基，每皿更换7ml上一步预热的D2.5，放入培养箱中备用，注意避免细胞脱落；

6.准备涡旋仪，70%酒精擦拭消毒后置于无菌操作台备用；

7.根据下表准备DNA混合液（该体系以慢病毒包装载体pMD2G和psPAX为例，为1个100mm培养皿用量）：

试剂	用量
pMD2G	6μg
PSPAX	15μg
慢病毒表达载体	20μg
H2O	Add H₂O to 450μl

8.边涡旋边逐滴加入50μl Solution 1，以充分混匀；

注：以上所用试剂均需恢复至室温，阳性对照组用CMV-EGFP代替慢病毒表达载体。

9.在15ml离心管中准备等体积500μl Solution 2，在涡旋仪上快速涡旋，同时逐滴加入配制好的DNA混合液（该过程必须逐滴加入）；滴加结束后再涡旋5-10s；

注：因Solution 2 pH对温度非常敏感，必须恢复至室温后使用。

10.将混合液室温孵育20min；

11.同时，在待转染细胞培养皿中加入8μl Solution4，混匀后放于培养箱备用；

12.孵育结束后用移液枪或移液管轻轻混匀混合液，此时可见混合液略有浑浊；

注：混匀一定要轻柔，可通过吹泡泡 (bubble mix）的方式混匀。

13.将混合液逐滴均匀滴加至培养皿中，前后左右轻轻晃动培养皿，充分混匀；

14.将培养皿放于含3%CO₂培养箱中培养；

15.12-16h之后（不超过16h），37℃预热DMEM无血清培养基（可用PBS代替）和D2.5；

16.吸去培养皿中培养基，用预热的DMEM无血清培养基轻轻洗2次，10ml/次，之后加入10ml上步预热的D2.5，混匀后置于含5%CO₂培养箱中37℃培养；

17.转染36-48h后收集培养上清，2200rpm，4℃离心10min去除细胞碎片，置于4℃冰箱短期保存（不超过2天），或分装后于-80℃长期保存。

注：冻存的病毒应在冰上或4℃解冻，且避免反复冻融。

18.收集的病毒上清可直接用于滴度测定，或浓缩后分装保存；

本公司同时提供病毒浓缩试剂（货号：GE-19002-50），可方便快捷高效地浓缩病毒，不需要超速离心机。

滴度测定（流式法）

注：该方法适用于含有EGFP等荧光蛋白标记的病毒载体，或可通过流式检测目的蛋白的病毒载体的滴度测定；本公司也提供慢病毒滴度检测试剂盒（货号：GE-20006-100），可通过Real-time PCR检测病毒滴度，适用于全部慢病毒。

1.提前一天接种293T细胞于96孔板，每孔1×10^4细胞，100μl；培养过夜；

注：每种病毒准备6个孔，另需额外准备10个孔用于细胞计数。

2.准备含有1× Solution 5的DMEM完全培养基（10%FBS），37℃预热；

3.消化10孔细胞，计数，算出每孔细胞数N；

4.根据下图逐级稀释病毒，并在对应细胞中加入10μl稀释好的病毒；

注：浓缩的病毒可稀释10倍后再逐级稀释。

5.每孔加入100μl准备好的DMEM完全培养基，2000rpm，30℃离心1h；

6.离心结束后将细胞放回培养箱中培养；

7.72h后，收集细胞，流式测定阳性细胞百分比TM%，选择15-25%之间的TM%用于滴度计算；

8.根据以下公式计算病毒滴度：

Virus titer, TU/ml

DF：病毒稀释倍数；

V：每孔加入病毒体积，0.01ml；

常见问题：

常见问题	建议
转染孵育后沉淀不可见或太细	加入了太多的DNA。检查DNA的OD260并适当调整使用的体积或浓度。用不同数量的DNA转染以确定最佳浓度。
转染孵育后沉淀物密度太大，有聚集的团块	加入的DNA太少。检查DNA的OD260并适当调整使用的体积或浓度。用不同数量的DNA转染以确定最佳浓度。
无法从培养皿中洗去沉淀物	确保PBS不含Ca²⁺或Mg²⁺，洗液只含有配方中所列成分的阳离子。
转染效率高，但病毒滴度低	优化病毒表达质粒和包装质粒的比例和用量，理论上表达质粒越大，包装所需用量越多。

附录：

不同规格培养皿底包装体系参考:

	6孔板	10cm培养皿	15cm 培养皿
底面积	cm²	Cm²	Cm²
底面积比	1	5.7	15.8
转染前换液体积	1.226 ml	7 ml	17.5 ml
DNA-CaPO₄ mixture体积	0.174 ml	1 ml	1.5 ml
培养体积	2 ml	10 ml	25 ml
洗涤体积	2 ml	10 ml	25 ml