Acme-packaging病毒包装试剂盒

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Acme-packaging病毒包装试剂盒
Acme-packaging病毒包装试剂盒
 
本试剂盒包含能够快速、简便、高效地对293T细胞进行质粒转染的必要试剂,可同时用于慢病毒和逆转录病毒的包装,可在100mm培养皿中进行20-50次转染。Solution 1和Solution2用于形成CaPO4沉淀;Solution3为本公司生产并经严格筛选的胎牛血清,用于病毒包装过程中添加到细胞培养基中;Solution 4为病毒包装增强试剂,可有效提过病毒包装效率;Solution 5为病毒感染增强试剂,用于靶细胞感染;Controlplasmid为EGFP慢病毒质粒,用于包装阳性对照病毒。

规格:详见产品内容
   

              产品号:

              # GE-19001-20/50


             
产品内容:

试剂名称

内容

规格

储存

条件

-20T

-50T

Solution 1

2.5M CaCl2

2ml

5ml

-20oC

Solution2

2× BBS

10ml

25ml

Solution 3

Modified Fetal bovine serum

10ml

25ml

Solution 4

Packaging Enhancer (1000×)

100μl

250μl

Solution 5

Infection Enhancer (1000×)

100μl

250μl

Controlplasmid

CMV-EGFP

40μg

100μg

UltrapureH2O

H2O

10ml

25ml

4oC

注:Solution 1、Solution 2应避免反复冻融,请根据实验情况分装使用。


其他所需材料:
超纯水
293T (Acme-293T,东岭生物)
DMEM高糖培养基
Fetal bovine serum (FBSV500,东岭生物)
磷酸盐缓冲液 (PBS: 137 mM NaCl, 2.6 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, Adjust the pH to 7.4 with HCl)


简介:
在包装重组病毒的过程中,质粒转染是影响病毒包装效果的重要一步。本试剂盒是基于CaPO4法开发的病毒包装试剂盒,在293T细胞中有非常好的转染效果。
CaPO4法最初是作为检测病毒DNA传染性的一种技术而发展起来的,由CaPO4形成的沉淀通过增强DNA对细胞膜的吸附作用,促进哺乳动物细胞对DNA的摄取,从而达到转染的目的。CaPO4沉淀还限制了哺乳动物细胞内DNA酶对DNA的消化。
本试剂盒包含能够快速、简便、高效地对293T细胞进行质粒转染的必要试剂,可同时用于慢病毒和逆转录病毒的包装,可在100mm培养皿中进行20-50次转染。Solution 1和Solution2用于形成CaPO4沉淀;Solution3为本公司生产并经严格筛选的胎牛血清,用于病毒包装过程中添加到细胞培养基中;Solution 4为病毒包装增强试剂,可有效提过病毒包装效率;Solution 5为病毒感染增强试剂,用于靶细胞感染;Controlplasmid为EGFP慢病毒质粒,用于包装阳性对照病毒。


操作流程:



操作步骤:

请在实验开始前认真阅读完整实验步骤
本说明概述了使用100mm细胞培养皿进行瞬时转染包装慢病毒所需的步骤,逆转录病毒包装体系及条件略有不同。如果使用其他规格培养皿,请根据培养皿底面积按比例调整相关试剂用量(参考附录)。质粒用量及比例可根据推荐用量做优化。
病毒包装对细胞状态有较高要求,推荐使用传代次数较低、扩增倍数稳定、形态正常的细胞用于包装。
病毒包装:

1.提前一天消化293T细胞,重悬于37℃预热的DMEM完全培养基中(10%FBS,无抗生素,以下简称为D10),计数;

2.每个培养皿接种4.5×10^6细胞,10mlD10,轻轻晃动,将细胞完全混匀;

3.在含5%CO2培养箱中37℃培养过夜(转染前细胞密度应达到60%-70%,可根据细胞生长速度对细胞接种量作调整);

4.转染前3h配制含有2.5%Solution3的DMEM培养基(以下简称为D2.5,不含双抗),37℃预热备用;

5.转染前2h吸去培养皿中培养基,每皿更换7ml上一步预热的D2.5,放入培养箱中备用,注意避免细胞脱落;

6.准备涡旋仪,70%酒精擦拭消毒后置于无菌操作台备用;

7.根据下表准备DNA混合液(该体系以慢病毒包装载体pMD2G和psPAX为例,为1个100mm培养皿用量):

试剂

用量

pMD2G

6μg

PSPAX

15μg

慢病毒表达载体

20μg

H2O

Add H2O to 450μl

8.边涡旋边逐滴加入50μl Solution 1,以充分混匀;

       注:以上所用试剂均需恢复至室温,阳性对照组用CMV-EGFP代替慢病毒表达载体。

9.在15ml离心管中准备等体积500μl Solution 2,在涡旋仪上快速涡旋,同时逐滴加入配制好的DNA混合液(该过程必须逐滴加入);滴加结束后再涡旋5-10s;

       注:因Solution 2 pH对温度非常敏感,必须恢复至室温后使用。

10.将混合液室温孵育20min;

11.同时,在待转染细胞培养皿中加入8μl Solution4,混匀后放于培养箱备用;

12.孵育结束后用移液枪或移液管轻轻混匀混合液,此时可见混合液略有浑浊;

       注:混匀一定要轻柔,可通过吹泡泡 (bubble mix)的方式混匀。

13.将混合液逐滴均匀滴加至培养皿中,前后左右轻轻晃动培养皿,充分混匀;

14.将培养皿放于含3%CO2培养箱中培养;

15.12-16h之后(不超过16h),37℃预热DMEM无血清培养基(可用PBS代替)和D2.5;

16.吸去培养皿中培养基,用预热的DMEM无血清培养基轻轻洗2次,10ml/次,之后加入10ml上步预热的D2.5,混匀后置于含5%CO2培养箱中37℃培养;

17.转染36-48h后收集培养上清,2200rpm,4℃离心10min去除细胞碎片,置于4℃冰箱短期保存(不超过2天),或分装后于-80℃长期保存。

     注:冻存的病毒应在冰上或4℃解冻,且避免反复冻融。

18.收集的病毒上清可直接用于滴度测定,或浓缩后分装保存;

本公司同时提供病毒浓缩试剂(货号:GE-19002-50),可方便快捷高效地浓缩病毒,不需要超速离心机。


滴度测定(流式法)
注:该方法适用于含有EGFP等荧光蛋白标记的病毒载体,或可通过流式检测目的蛋白的病毒载体的滴度测定;本公司也提供慢病毒滴度检测试剂盒(货号:GE-20006-100),可通过Real-time PCR检测病毒滴度,适用于全部慢病毒。

1.提前一天接种293T细胞于96孔板,每孔1×10^4细胞,100μl;培养过夜;

     注:每种病毒准备6个孔,另需额外准备10个孔用于细胞计数。

2.准备含有1× Solution 5的DMEM完全培养基(10%FBS),37℃预热;

3.消化10孔细胞,计数,算出每孔细胞数N;

4.根据下图逐级稀释病毒,并在对应细胞中加入10μl稀释好的病毒;


      注:浓缩的病毒可稀释10倍后再逐级稀释。

5.每孔加入100μl准备好的DMEM完全培养基,2000rpm,30℃离心1h;

6.离心结束后将细胞放回培养箱中培养;

7.72h后,收集细胞,流式测定阳性细胞百分比TM%,选择15-25%之间的TM%用于滴度计算;

8.根据以下公式计算病毒滴度:

Virus titer, TU/ml

DF:病毒稀释倍数;

V:每孔加入病毒体积,0.01ml;


常见问题:

常见问题

建议

转染孵育后沉淀不可见或太细
加入了太多的DNA。检查DNA的OD260并适当调整使用的体积或浓度。用不同数量的DNA转染以确定最佳浓度。
转染孵育后沉淀物密度太大,有聚集的团块
加入的DNA太少。检查DNA的OD260并适当调整使用的体积或浓度。用不同数量的DNA转染以确定最佳浓度。
无法从培养皿中洗去沉淀物
确保PBS不含Ca2+或Mg2+,洗液只含有配方中所列成分的阳离子。
转染效率高,但病毒滴度低
优化病毒表达质粒和包装质粒的比例和用量,理论上表达质粒越大,包装所需用量越多。

附录:
不同规格培养皿底包装体系参考:

6孔板

10cm培养皿

15cm 培养皿

底面积

cm2

Cm2

Cm2

底面积比

1

5.7

15.8

转染前换液体积

1.226 ml 

7 ml

17.5 ml

DNA-CaPO4 mixture体积

0.174 ml

1 ml

1.5 ml

培养体积

2 ml

10 ml

25 ml

洗涤体积

2 ml

10 ml

25 ml