支原体检测试剂盒
Mycoplasma Determination Kit
产品介绍：
细胞培养是生命科学研究中常用的实验手段。不同于其它常用的实验方法，细胞培养是一个动态的连续过程，细胞通常会对操作失误或污染物有所反应，这些反应往往表现出不正常的细胞状态或培养基外观。如果受到支原体污染时，细胞形态较之无明显变化，污染前期极易被忽视，直到污染非常严重时才能发现。受污染的细胞膜上可能有几百个支原体，这些支原体竞争营养并释放有毒的代谢产物，严重影响实验结果。污染来源包括工作环境、操作者本身（一些支原体是人体的正常菌群）、培养基、血清、细胞交叉污染、实验器材和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。
确认细胞培养过程中出现问题的潜在原因是一项困难且耗时的任务，在细胞培养中，任何突然的变化都应该被怀疑，同时良好的试验规范和定期检测支原体污染也十分必要。支原体检测的方法有很多种，如直接培养、DNA 荧光染色、ELISA和PCR 法等。
东岭生物（苏州）支原体检测试剂盒主要采用PCR方法对各种生物材料（如细胞培养物、实验动物分泌物、动物血清等）支原体感染的检测。它综合了几个优势：灵敏、特异、快速并且可以用直接用细胞培养上清液检测。本制品通过PCR方法检测培养细胞等生物材料中的支原体，所用引物为根据支原体16S-23S rRNA序列保守区域设计，只特异性扩增支原体 DNA，检出灵敏度与特异性均较高。PCR 扩增及电泳分析只需数个小时，操作方便简单。
产品信息：
组分编号 | 组分名称 | 规格 | 储存条件 |
-A | Green Taq Mix | 250µl | -20℃ |
-B | ddH2O | 250µl | |
-C | Positive Control Template | 50µl | |
-D | Primers | 50µl |
使用说明：
请详细阅读使用说明后再开始相关实验。
1.待测细胞连续传代3次或培养至两周；
2.细胞达到80% confluency或以上的时候，取1ml上清，进行低速离心（300g，5min，4℃）；
3.离心结束后取950μl上清液，转移至新的无菌EP管中，以去除培养基中的细胞；
4.将上清液高速离心（12000g，10min，4℃），离心结束后，去除900μl上清，剩余50ul用以重悬沉淀（可能肉眼不可见）；
5.将重悬好的沉淀放置4度冰箱，作为PCR的模板备用；
根据下表，配制PCR反应液：
试剂 | 实验组 | 阳性对照 | 阴性对照 |
A | 12.5µl | 12.5µl | 12.5µl |
待测样品 | 5µl | ||
C | 5µl | ||
B | 5.5µl | 5.5µl | 10.5µl |
D | 2µl | 2µl | 2µl |
注：为防止 Positive Control Template 污染，请将实验组和阴性对照组加完以后，最后再将 c液加入阳性对照组
6.PCR程序：
步骤 | 温度 | 反应时间 | 循环数 |
Step 1 | 95℃ | 5min | 1 |
Step 2 | 94℃ | 30s | 5 |
50℃ | 30s | ||
72℃ | 35s | ||
Step 3 | 94℃ | 15s | 23 |
56℃ | 15s | ||
72℃ | 30s | ||
Hold | 12℃ | ∞ |
7.制备DNA gel：称取一定量Argrose粉末，用1X TAE buffer配制成1.5%的DNA GEL；
8.待PCR反应结束后，取8-10μl的PCR 反应液（无需要加 loading buffer）直接进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物；
9.目的条带为518bp。示例如下：
推荐使用频率：
新细胞进入实验室 | 必检 |
液氮保存前 | 必检 |
定期常规 | 每月一次 |
发现污染后 | 每周一次 |
发现细胞异常 | 随时检测 |