小鼠CD11b+cDC2树突状细胞培养试剂盒
MouseCD11b+cDC2 Dendritic Cell Culture Kit
产品介绍：
小鼠CD11b+cDC2树突状细胞培养试剂盒（Catalog # CS-20002-100）是为在体外培养和诱导小鼠造血前体细胞向成熟CD11b+cDC2树突状细胞（DC）亚群分化发育而专门设计的一款含血清培养基套装。该培养试剂盒可在10天内诱导cDC2（CD11c+ MHCII+ CD11b+CD8-）亚群产生，是研究cDC2分化发育和功能、以及产生小鼠DC疫苗的重要培养系统。
小鼠CD11b+cDC2树突状细胞培养试剂盒包含100ml小鼠CD11b+cDC2树突状细胞基础培养基、0.5ml小鼠CD11b+cDC2树突状细胞扩增补充因子、0.5ml小鼠CD11b+cDC2树突状细胞分化补充因子和10ml预筛选树突状细胞专用胎牛血清。基础培养基含有小鼠树突状细胞生长的基础营养成分，不含树突状细胞扩增、分化发育所需的细胞因子。扩增补充因子包含小鼠造血前体细胞扩增所需的所有细胞因子，分化补充因子包含小鼠CD11b+cDC2树突状细胞分化发育所需的所有细胞因子，二者均以100X的储存液提供给用户。产品信息：
产品名称 | Cat log # | 规格 | 储存条件 |
小鼠CD11b+cDC2树突状细胞培养试剂盒 | CS-20002-100 | 1 kit | |
小鼠CD11b+cDC2树突状细胞基础培养基 | CS-20002-B | 100ml | 4oC |
小鼠CD11b+cDC2树突状细胞扩增补充因子 | CS-20002-EXS | 0.35ml | -20oC |
小鼠CD11b+cDC2树突状细胞分化补充因子 | CS-20002-DES | 0.65ml | -20oC |
预筛选树突状细胞专用胎牛血清 | CS-DCF-10 | 10ml | -20oC |
其他本试剂盒未提供但需用的重要试剂和组分：
小鼠c-kit+造血前体细胞磁珠分选试剂；
完全培养基配制：
在无菌生物安全柜中，开展以下操作：
1.在4度冰箱解冻补充因子和胎牛血清，混匀后使用。
注：解冻后的补充因子和血清可放置于4oC冰箱，在1个月内使用；或者分装至合适体积后，保存于-20oC冰箱，不可反复冻融！
2.
扩增培养基配制：将1体积的扩增补充因子和10体积的血清加入到89体积的基础培养基中，充分混匀，得到小鼠cDC2树突状细胞扩增培养基。如取100ul补充因子和1ml血清加入至8.9ml基础培养基，以此类推。
分化培养基配制：将1体积的分化补充因子和10体积的血清加入到89体积的基础培养基中，充分混匀，得到小鼠cDC2树突状细胞分化培养基。
注：配好的完全培养基请于4oC保存，且于1个月内使用完毕。
使用说明：
请详细阅读使用说明后再开始相关实验。
1.使用淋巴细胞分离液从小鼠骨髓总细胞中分离得到骨髓单个核细胞（BM-MNC），计数。
2.使用磁珠分选BM-MNC中c-kit+造血前体细胞（参考所使用试剂盒的说明书），计数。
注：一只小鼠骨髓中约含有1.5*10^6 c-kit+造血前体细胞，可根据需要调整进入分选的BM-MNC细胞量。
3.D0：使用扩增培养基重悬BM-MNC，调整细胞密度至2.5*10^4/ml，按照如下表格所示将细胞铺于培养板：
培养板 | 完全培养基体积 | c-kit+造血前体细胞数/孔 |
24孔板 | 1ml | 2.5*10^4 |
6孔板 | 4ml | 1*10^5 |
4.将培养板置于细胞培养箱，37 oC，5%CO2，静置培养。
5.D3：扩孔。轻轻吹打孔内细胞及培养基，按照1:3将原孔内悬浮细胞平均分至3个新孔中，同时补加新鲜扩增培养基至初始培养体积（步骤3表格）。
注：完全培养基请恢复至室温后使用，减少对细胞的刺激；
6.D6：
1)扩孔：轻轻吹打孔内细胞及培养基，按照1:2将原孔内悬浮细胞平均分至2个新孔中；
2)诱导分化：在每个新孔内，补加等量分化培养基；
注：
由于培养过程中培养基的挥发造成体积损失，该步骤加入分化培养基时可按照24孔板每孔加入0.5ml或6孔板每孔加入2ml分化培养基计算。
D6时培养板底会有一定量贴壁细胞出现，扩孔时请轻轻吹打细胞，只将悬浮细胞转移至新孔。贴壁细胞多为巨噬细胞，会影响最终DC纯度。
7.D8：
1)小心贴培养板侧壁用枪尖吸走1/2体积旧培养基；
2)转孔：轻轻吹打细胞，收集悬浮细胞，按照1:1将原孔内悬浮细胞转移至新孔中。补充新鲜分化培养基至初始体积（步骤3表格）。
8.D10：轻轻吹打细胞，收集悬浮细胞，即为分化成熟的小鼠cDC2，可进行后续操作和分析。
注：如需研究特定刺激对DC的影响，可提前加入相应刺激，待D10收集细胞进行分析。
数据展示：
图：小鼠CD11b+cDC2树突状细胞鉴定。取4-6周龄雄性C57BL/6小鼠按照上述说明培养CD11b+cDC2至第10天，收集悬浮细胞检测DC产生和亚群分布。