苏州东岭生物技术有限公司 | CRISPR CAS9敲除敲入服务

CRISPR敲除敲入服务

CRISPR/Cas9是一种在特定目标位置切割DNA的工具，Cas9蛋白可在sgRNA的引导下对特定基因进行剪切，从而达到基因敲除、敲入以及修饰、调控等目的。

敲除：与常规的shRNA敲低不同，CRISPR/CAS9和sgRNA可特异性的在基因组水平造成碱基的缺失或插入（INDEL），造成原有基因表达框的破坏，造成靶基因蛋白水平的完全敲除（图1左）。

敲入：与常规病毒介导的过表达不同，CRISPR/CAS9和sgRNA在特定基因组位点切割后，可在带有同源臂的修复模板引导下，将待敲入的基因插入到目的位点，不同于病毒介导的随机整合（图1右）。

图1：CRISPR/CAS9工作示意图

图片出引自：Front. Plant Sci., 24 May 2016

东岭团队经过长期积累，已改造获得多种CRISPR/CAS9及sgRNA相关载体用于敲除和敲入，具体信息如下表：

敲除/敲入关键组分	形式	内容
CAS9	质粒载体	SpCAS9慢病毒载体
CAS9	病毒	SpCAS9-PuroR SpCAS9-NeoR SpCAS9-GFP SpCAS9-mCherry
sgRNA	质粒载体	sgRNA慢病毒载体： U6-sgRNA-GFP U6-sgRNA- mCherry U6-sgRNA- PuroR U6-sgRNA- NeoR U6-sgRNA- ZeoR U6-sgRNA-GFP- PuroR U6-sgRNA-mCherry- PuroR
sgRNA	病毒	Scramble sgRNA-GFP- PuroR病毒现货；定制sgRNA病毒；
同源重组供体模板（HR template）	质粒载体（puc19骨架非病毒载体）	LR MCS-GFP- RA MCS； LR MCS-mCherry -RA MCS； LR MCS-GFP-PuroR-RA MCS； LR MCS-mCherry-PuroR-RA MCS

注：HR-同源重组；LR-左臂同源臂；RA-右臂同源臂；MCS-多克隆位点；

东岭提供CRISPR/CAS9敲除和敲入环节所需的载体和病毒，亦可为客户提供一站式服务，周期及项目见下表：

注：定制服务包括敲入服务、稳定细胞株构建。

服务项目：

服务		描述
验证服务	T7E1 检测	基因组水平功能验证：检测通过CRISPR介导的特定位点NHEJ修复造成的INDEL
验证服务	qPCR 检测	基因组水平功能验证：检测由CRISPR介导的特定位点转录激活/抑制造成的基因表达水平变化
同源重组供体载体服务	供体载体克隆设计及构建	定制质粒用于通过同源重组将目的基因、筛选标记或其他基因元件转移至特定位点。我们可提供携带不同筛选标记和基因元件的供体载体满足您的需求。
稳定细胞株服务	单克隆细胞株	CRISPR/CAS9介导的基因编辑单克隆细胞株

针对不同类型细胞株，东岭推出如下不同的方案用于构建敲除细胞株：

上述针对难以转染的细胞株不同方案之间的优缺点列表如下：

	优点	缺点
方案1	无需包装病毒电转可达到高转染效率	电转条件待摸索电转可能造成细胞死亡严重
方案2	sgRNA/CAS9在一个质粒中一步将sgRNA和CAS9导入细胞	CAS9接近4kb，病毒包装效率低
方案3	sgRNA单独包装病毒效率高	需先构建CAS9稳转靶细胞株

东岭CRISPR/CAS9基因敲除单克隆细胞株案例（方案2）：

图2：将针对靶基因设计的5条sgRNA构建到sgRNA病毒载体，通过顺转导入CAS9稳转工具细胞株，可到＞70%转染效率。转染3天后收集细胞基因组进行T7E1检测sgRNA切割效率，可见sgRNA 1/ 2/ 3/ 5均有较高切割效率。

图3：选取sgRNA1和sgRNA2包装病毒，感染CAS9稳转靶细胞株。3天后收集细胞基因组进行T7E1检测sgRNA切割效率，可见sgRNA 1多克隆细胞有较高靶基因切割效率。

图4：将sgRNA1多克隆细胞进行单克隆铺板，扩增后的单克隆收集基因组通过PCR获得目的基因片段，进行测序发现克隆1/2分别有单个碱基和多个碱基的缺失突变，靶基因敲除单克隆细胞株构建成功。

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