CRISPR/Cas9是一种在特定目标位置切割DNA的工具,Cas9蛋白可在sgRNA的引导下对特定基因进行剪切,从而达到基因敲除、敲入以及修饰、调控等目的。
敲除:与常规的shRNA敲低不同,CRISPR/CAS9和sgRNA可特异性的在基因组水平造成碱基的缺失或插入(INDEL),造成原有基因表达框的破坏,造成靶基因蛋白水平的完全敲除(图1左)。
敲入:与常规病毒介导的过表达不同,CRISPR/CAS9和sgRNA在特定基因组位点切割后,可在带有同源臂的修复模板引导下,将待敲入的基因插入到目的位点,不同于病毒介导的随机整合(图1右)。
图1:CRISPR/CAS9工作示意图
图片出引自:Front. Plant Sci., 24 May 2016
敲除/敲入关键组分 | 形式 | 内容 |
CAS9 | 质粒载体 | SpCAS9慢病毒载体 |
病毒 | SpCAS9-PuroR SpCAS9-NeoR SpCAS9-GFP SpCAS9-mCherry | |
sgRNA | 质粒载体 | sgRNA慢病毒载体: U6-sgRNA-GFP U6-sgRNA- mCherry U6-sgRNA- PuroR U6-sgRNA- NeoR U6-sgRNA- ZeoR U6-sgRNA-GFP- PuroR U6-sgRNA-mCherry- PuroR |
病毒 | Scramble sgRNA-GFP- PuroR病毒现货; 定制sgRNA病毒; | |
同源重组供体模板 (HR template) | 质粒载体 (puc19骨架非病毒载体) | LR MCS-GFP- RA MCS; LR MCS-mCherry -RA MCS; LR MCS-GFP-PuroR-RA MCS; LR MCS-mCherry-PuroR-RA MCS |
注:HR-同源重组;LR-左臂同源臂;RA-右臂同源臂;MCS-多克隆位点;
东岭提供CRISPR/CAS9敲除和敲入环节所需的载体和病毒,亦可为客户提供一站式服务,周期及项目见下表:
服务项目 | 2周 | 3-5周 | 3-5周 | 7-8周 | 2-6月 |
基因编辑工具设计 | √ | √ | √ | √ | |
克隆载体及测序 | √ | √ | √ | √ | |
质粒水平功能验证 | √ | √ | |||
基因组水平功能验证 | √ | √ | |||
定制服务 | √ |
注:定制服务包括敲入服务、稳定细胞株构建。
服务项目:
服务 | 描述 | |
验证服务 | T7E1 检测 | 基因组水平功能验证:检测通过CRISPR介导的特定位点NHEJ修复造成的INDEL |
qPCR 检测 | 基因组水平功能验证:检测由CRISPR介导的特定位点转录激活/抑制造成的基因表达水平变化 | |
同源重组 供体载体服务 | 供体载体克隆 设计及构建 | 定制质粒用于通过同源重组将目的基因、筛选标记或其他基因元件转移至特定位点。我们可提供携带不同筛选标记和基因元件的供体载体满足您的需求。 |
稳定细胞株服务 | 单克隆细胞株 | CRISPR/CAS9介导的基因编辑单克隆细胞株 |
针对不同类型细胞株,东岭推出如下不同的方案用于构建敲除细胞株:
上述针对难以转染的细胞株不同方案之间的优缺点列表如下:
优点 | 缺点 | |
方案1 |
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方案2 |
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方案3 |
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东岭CRISPR/CAS9基因敲除单克隆细胞株案例(方案2):

图2:将针对靶基因设计的5条sgRNA构建到sgRNA病毒载体,通过顺转导入CAS9稳转工具细胞株,可到>70%转染效率。转染3天后收集细胞基因组进行T7E1检测sgRNA切割效率,可见sgRNA 1/ 2/ 3/ 5均有较高切割效率。

图3:选取sgRNA1和sgRNA2包装病毒,感染CAS9稳转靶细胞株。3天后收集细胞基因组进行T7E1检测sgRNA切割效率,可见sgRNA 1多克隆细胞有较高靶基因切割效率。
图4:将sgRNA1多克隆细胞进行单克隆铺板,扩增后的单克隆收集基因组通过PCR获得目的基因片段,进行测序发现克隆1/2分别有单个碱基和多个碱基的缺失突变,靶基因敲除单克隆细胞株构建成功。
相关产品列表:
产品名称 | 货号 |
spCAS9-PuroR慢病毒 | GE-20002-P |
spCAS9-GFP慢病毒 | GE-20002-G |
Scramble sgRNA-GFP-PuroR病毒 | GE-20004-PG |
sgRNA-Puro/mCherry 病毒载体 | GE-20005-PC |
sgRNA-mCherry 病毒载体 | GE-20005-C |
sgRNA-GFP 病毒载体 | GE-20005-G |
sgRNA-Zeocin 病毒载体 | GE-20005-Z |
sgRNA-Neomycin 病毒载体 | GE-20005-N |
sgRNA-Puro病毒载体 | GE-20005-P |
sgRNA-Puro/GFP 病毒载体 | GE-20005-PG |
CRISPR KI donor载体 | GE-20003 |
spCAS9-Puro/GFP稳转细胞株293T | CL2001-01 |
spCAS9-Puro/GFP稳转细胞株HCT116 | CL2001-03 |
spCAS9-Puro/GFP稳转细胞株3T3 | CL2001-02 |
spCAS9-Puro/GFP稳转细胞株HL60 | CL2001-07 |
spCAS9-Puro/GFP稳转细胞株K562 | CL2001-06 |
spCAS9-Puro/GFP稳转细胞株SW480 | CL2001-05 |
spCAS9-Puro/GFP稳转细胞株HT29 | CL2001-04 |