CRISPR敲除敲入服务

CRISPR/Cas9是一种在特定目标位置切割DNA的工具,Cas9蛋白可在sgRNA的引导下对特定基因进行剪切,从而达到基因敲除、敲入以及修饰、调控等目的。

敲除与常规的shRNA敲低不同,CRISPR/CAS9和sgRNA可特异性的在基因组水平造成碱基的缺失或插入(INDEL),造成原有基因表达框的破坏,造成靶基因蛋白水平的完全敲除(图1左)。

敲入与常规病毒介导的过表达不同,CRISPR/CAS9和sgRNA在特定基因组位点切割后,可在带有同源臂的修复模板引导下,将待敲入的基因插入到目的位点,不同于病毒介导的随机整合(图1右)。



1:CRISPR/CAS9工作示意图

图片出引自:Front. Plant Sci., 24 May 2016


东岭团队经过长期积累,已改造获得多种CRISPR/CAS9及sgRNA相关载体用于敲除和敲入,具体信息如下表:

敲除/敲入关键组分

形式

内容

CAS9

质粒载体

SpCAS9慢病毒载体

病毒

SpCAS9-PuroR

SpCAS9-NeoR

SpCAS9-GFP

SpCAS9-mCherry

sgRNA

质粒载体

sgRNA慢病毒载体:

U6-sgRNA-GFP

U6-sgRNA- mCherry

U6-sgRNA- PuroR

U6-sgRNA- NeoR

U6-sgRNA- ZeoR

U6-sgRNA-GFP- PuroR

U6-sgRNA-mCherry- PuroR

病毒

Scramble sgRNA-GFP- PuroR病毒现货;

定制sgRNA病毒;

同源重组供体模板

HR template

质粒载体

puc19骨架非病毒载体)

LR MCS-GFP- RA MCS

LR MCS-mCherry -RA MCS

LR MCS-GFP-PuroR-RA MCS

LR MCS-mCherry-PuroR-RA MCS

注:HR-同源重组;LR-左臂同源臂;RA-右臂同源臂;MCS-多克隆位点;


东岭提供CRISPR/CAS9敲除和敲入环节所需的载体和病毒,亦可为客户提供一站式服务,周期及项目见下表:

服务项目

2

3-5

3-5

7-8

2-6

基因编辑工具设计

克隆载体及测序

质粒水平功能验证

基因组水平功能验证

定制服务

注:定制服务包括敲入服务、稳定细胞株构建。


服务项目:

服务

描述

验证服务

T7E1 检测

基因组水平功能验证:检测通过CRISPR介导的特定位点NHEJ修复造成的INDEL

qPCR 检测

基因组水平功能验证:检测由CRISPR介导的特定位点转录激活/抑制造成的基因表达水平变化

同源重组

供体载体服务

供体载体克隆

设计及构建

定制质粒用于通过同源重组将目的基因、筛选标记或其他基因元件转移至特定位点。我们可提供携带不同筛选标记和基因元件的供体载体满足您的需求。

稳定细胞株服务

单克隆细胞株

CRISPR/CAS9介导的基因编辑单克隆细胞株



针对不同类型细胞株,东岭推出如下不同的方案用于构建敲除细胞株:


      


  


上述针对难以转染的细胞株不同方案之间的优缺点列表如下:

 优点

 缺点

方案1

  • 无需包装病毒
  • 电转可达到高转染效率
  • 电转条件待摸索
  • 电转可能造成细胞死亡严重

方案2

  • sgRNA/CAS9在一个质粒中
  • 一步将sgRNACAS9导入细胞
  • CAS9接近4kb,病毒包装效率低

方案3

  • sgRNA单独包装病毒效率高
  • 需先构建CAS9稳转靶细胞株


东岭CRISPR/CAS9基因敲除单克隆细胞株案例(方案2):


 

2:将针对靶基因设计的5条sgRNA构建到sgRNA病毒载体,通过顺转导入CAS9稳转工具细胞株,可到>70%转染效率。转染3天后收集细胞基因组进行T7E1检测sgRNA切割效率,可见sgRNA 1/ 2/ 3/ 5均有较高切割效率。


 

3:选取sgRNA1和sgRNA2包装病毒,感染CAS9稳转靶细胞株。3天后收集细胞基因组进行T7E1检测sgRNA切割效率,可见sgRNA 1多克隆细胞有较高靶基因切割效率。




图4:将sgRNA1多克隆细胞进行单克隆铺板,扩增后的单克隆收集基因组通过PCR获得目的基因片段,进行测序发现克隆1/2分别有单个碱基和多个碱基的缺失突变,靶基因敲除单克隆细胞株构建成功。


相关产品列表:


产品名称

货号

spCAS9-PuroR慢病毒

GE-20002-P

spCAS9-GFP慢病毒

GE-20002-G

Scramble sgRNA-GFP-PuroR病毒

GE-20004-PG

sgRNA-Puro/mCherry 病毒载体

GE-20005-PC

sgRNA-mCherry 病毒载体

GE-20005-C

sgRNA-GFP 病毒载体

GE-20005-G

sgRNA-Zeocin 病毒载体

GE-20005-Z

sgRNA-Neomycin 病毒载体

GE-20005-N

sgRNA-Puro病毒载体

GE-20005-P

sgRNA-Puro/GFP 病毒载体

GE-20005-PG

CRISPR KI donor载体

GE-20003

spCAS9-Puro/GFP稳转细胞株293T

CL2001-01

spCAS9-Puro/GFP稳转细胞株HCT116

CL2001-03

spCAS9-Puro/GFP稳转细胞株3T3

CL2001-02

spCAS9-Puro/GFP稳转细胞株HL60

CL2001-07

spCAS9-Puro/GFP稳转细胞株K562

CL2001-06

spCAS9-Puro/GFP稳转细胞株SW480

CL2001-05

spCAS9-Puro/GFP稳转细胞株HT29

CL2001-04